細胞培養注意事項

1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。

3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol 之產生，，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5. 定期檢測下列項目：5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000 小時/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水

現在做細胞培養實驗的實驗室越來越多，如果打算開展或者已經開展的單位或者實驗室更要做到以下幾點。

 

1、選擇正確的培養基

在養細胞之前，就要了解，你所養細胞的來源以及種類和名稱，查閱一定量的文獻，確定所需培養液種類以及是否需要添加特殊成分，常用的細胞培養液有DMEM、RPMI1640、F12等等，一些常見的細胞基本可以使用這幾種培養基中的一種來培養，有的需要加入一定其他成分，這需要根據不同的細胞類型，查ATCC細胞庫或者查文獻，才能找到所需最佳培養液。選擇正確的培養液是養好細胞的第一步。

2、了解細胞的生長習性

不同的細胞生長習性不同。如成纖維細胞是貼壁生長，有一定的密度依賴性，密度小可能會出現不增殖，狀態差的情況，接種密度大時則需要隔天傳代，頻繁傳代則影響細胞狀態；再如RPMI-8226人多發性骨髓瘤細胞，是懸浮生長的，傳代需離心棄去上清即可?？傊?，了解細胞生長習性，再加上正確的計數，才能掌握好傳代的密度。

3、選擇優質的血清

血清中含有細胞生長所必須的生長因子，作為哺乳動物細胞培養的附加物，血清的添加是十分重要的，因此，選擇優質的血清，是細胞養殖成功與否的關鍵！

4、及時傳代和更換培養液

在細胞增殖到一定的密度后，要及時傳代，根據細胞的生長速度和密度，及時更換培養液。更換過勤，浪費培養液，更換不夠及時，則細胞狀態轉差，一般需隔天更換培養液，具體可根據所養細胞種類予以調整。

5、絕對的無菌意識

前面林林總總全部都注意好了，如果無菌意識差，細胞中混入了微生物，則千里之堤潰于蟻穴，細菌的生長速度和破壞力，將迅速占領培養皿，破壞細胞結構，有些初學者會在培養液中加入1%的雙抗，但是，無菌意識不強，雙抗亦無法拯救你的細胞！

6、傾心的呵護，頻繁的觀察

做到以上幾點，就可以開始養你的細胞了，但是再次重申細胞嬌弱，在養細胞的過程中，難免會出現一些意想不到的問題，要想成功養好細胞，時時惦記它
，頻繁地觀察，初期一天觀察2次都不足為過，出現任何預料外的情況，及時處理，才能保障收獲一盤“漂亮”的細胞。